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細(xì)胞毒素?zé)òl(fā)新活力：一種可應(yīng)用于納米孔技術(shù)、疫苗開(kāi)發(fā)和腫瘤治療的細(xì)菌毒力因子ClyA

上世紀(jì)90年代，Ludwig研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)：在大腸埃希氏菌K-12菌株中過(guò)表達(dá)傷寒沙門(mén)氏菌調(diào)控蛋白SlyA會(huì)導(dǎo)致合成一種新的細(xì)胞溶解素ClyA，使重組大腸埃希氏菌表現(xiàn)出溶血表型。ClyA是一種34kDa的孔道形成毒素，可由包括大腸桿菌和沙門(mén)氏菌在內(nèi)的某些腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生[1]。

自ClyA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，許多研究對(duì)它的結(jié)構(gòu)、功能以及毒力作用進(jìn)行了探索。ClyA在細(xì)菌胞內(nèi)合成可溶性單體后，通過(guò)外膜囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，在經(jīng)歷大規(guī)模構(gòu)象變化后在宿主細(xì)胞膜上形成環(huán)狀復(fù)合物跨膜孔道（圖1），從而造成宿主細(xì)胞的溶解和凋亡。

                  圖1：ClyA分泌及孔組裝途徑

ClyA在細(xì)菌毒力方面起著重要作用，同時(shí)，近年研究表明ClyA在生物技術(shù)應(yīng)用方面也存在巨大的潛力。這一“古老”的毒素蛋白在納米孔技術(shù)、疫苗開(kāi)發(fā)和腫瘤治療方面煥發(fā)了新的活力。孔道毒素可形成蛋白通道的結(jié)構(gòu)性質(zhì)使其被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)“納米孔”系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)無(wú)需標(biāo)記、化學(xué)修飾或表面固定的單分子分析。Maglia研究團(tuán)隊(duì)首次證明了ClyA在其納孔腔內(nèi)可以容納原生態(tài)折疊的蛋白質(zhì)。隨后的研究報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)了ClyA在作為檢測(cè)單個(gè)大分子的生物納孔方面的實(shí)用性[2]。ClyA還被應(yīng)用于開(kāi)發(fā)無(wú)電極納米孔傳感方法，可以在無(wú)電的情況下對(duì)單分子進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測(cè)。

ClyA通過(guò)外膜囊泡（OMVs）介導(dǎo)的分泌方式使其成為將外源蛋白或抗原傳遞到OMVs的理想融合蛋白和支架，使目標(biāo)蛋白或抗原能夠成功展示在釋放的OMVs表面。目前，工程化的ClyA-OMV系統(tǒng)已應(yīng)用于開(kāi)發(fā)多種病原體疫苗。當(dāng)把完整的鮑曼不動(dòng)桿菌Omp22蛋白與ClyA融合后展示在大腸埃希氏菌OMVs表面。接種工程化的OMVs可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗原特異性體液免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生免疫保護(hù)。此外，Yang研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了攜帶ClyA和SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)合域（RBD）融合蛋白的細(xì)菌仿生囊泡（BBV），并將這一系統(tǒng)與高壓均質(zhì)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)一步增強(qiáng)了RBD在BBV上的展示以及RBD-BBV的產(chǎn)量；在皮下注射RBD-BBV使其積聚在淋巴結(jié)中，促進(jìn)抗原的吸收和處理，從而引發(fā)小鼠對(duì)SARS-CoV-2的特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[3]。

在腫瘤治療方面，Ryan等人首次證明了融合了缺氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子的ClyA可增強(qiáng)腫瘤缺氧區(qū)域的壞死，并可抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)[4]。另一項(xiàng)研究使用ClyA-OMV系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）外域的展示。工程化的OMVs結(jié)合在腫瘤細(xì)胞表面的PD-1配體1上，從而促進(jìn)PD-1配體1的內(nèi)化，并降低其在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)水平。Thomas等人的最新研究顯示，透明質(zhì)酸酶（Hy）通過(guò)ClyA錨定在OMVs表面，使Hy更有效、更均勻地在腫瘤內(nèi)分布，促使藥物滲透并通過(guò)大幅降低腫瘤組織中透明質(zhì)酸水平來(lái)增強(qiáng)藥效。這些結(jié)果表明ClyA-OMV系統(tǒng)可能是進(jìn)行基質(zhì)重塑、溶細(xì)胞療法以及提高抗癌靶向治療活性的有效工具。

參考文獻(xiàn)：

1.Ludwig, A.; Tengel, C.; Bauer, S.; Bubert, A.; Benz, R.; Mollenkopf, H.J.; Goebel, W. SlyA, a regulatory protein from Salmonella typhimurium, induces a haemolytic and pore-forming protein in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 1995, 249, 474–486.

2.Franceschini, L.; Brouns, T.; Willems, K.; Carlon, E.; Maglia, G. DNA Translocation through Nanopores at Physiological Ionic

Strengths Requires Precise Nanoscale Engineering. ACS Nano 2016, 10, 8394–8402.

3.Huang, W.; Wang, S.; Yao, Y.; Xia, Y.; Yang, X.; Li, K.; Sun, P.; Liu, C.; Sun, W.; Bai, H.; et al. Employing Escherichia coli-derived

outer membrane vesicles as an antigen delivery platform elicits protective immunity against Acinetobacter baumannii infection. Sci.

Rep. 2016, 6, 37242.

4.Ryan, R.M.; Green, J.; Williams, P.J.; Tazzyman, S.; Hunt, S.; Harmey, J.H.; Kehoe, S.C.; Lewis, C.E. Bacterial delivery of a novel cytolysin to hypoxic areas of solid tumors. Gene Ther. 2009, 16, 329–339.